FerroFarRed (Fe2+ indicator) 亞鐵離子熒光探針

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

FerroFarRed，也稱為SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox，是一種特異性檢測(cè)不穩(wěn)定的鐵(II)離子（Fe²⁺）的熒光探針。FerroFarRed基本無熒光，一旦與Fe²⁺反應(yīng)后，不可逆的生成一種遠(yuǎn)紅熒光產(chǎn)物（Absmax=646nm，FLmax=662nm，圖1. FerroFarRed的光譜特征）。生理濃度下的鐵（III）離子（Fe³⁺）或其它除鐵離子以外的二價(jià)金屬離子都不會(huì)使其熒光增強(qiáng)（見圖2. FerroFarRed的金屬離子反應(yīng)特異性）。FerroFarRed具細(xì)胞膜滲透性和高選擇性，且在高達(dá)100μM的濃度下對(duì)細(xì)胞幾乎無毒性，適用于活細(xì)胞內(nèi)Fe²⁺的檢測(cè)，傾向定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）。適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀以及流式細(xì)胞儀（配置紅色激光器）分析。

圖1.FerroFarRed的光譜特征。FerroFarRed在0.05M HEPES buffer，pH 7.4下的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。FerroFarRed的最大吸收波長(zhǎng)在646nm，而最大熒光波長(zhǎng)在662nm。

圖2.FerroFarRed的金屬離子反應(yīng)特異性。FerroFarRed（5 μM）與各種金屬離子反應(yīng)后，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)：630nm，發(fā)射波長(zhǎng)665nm）。可見，僅與Fe2+反應(yīng)后發(fā)生顯著的熒光增強(qiáng)。

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

一、 需要自行準(zhǔn)備的材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)或超純DMSO【強(qiáng)烈建議將高純的DMSO分裝成單次用量保存在極低溫冷凍室內(nèi)，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能會(huì)增加FerroFarRed的背景信號(hào)】

1.2 合適的觀察緩沖液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；等）。不要含酚紅。

1.3    無血清細(xì)胞培養(yǎng)基（D-MEM等）

二、探針準(zhǔn)備

2.1從冰箱取出FerroFarRed，置于室溫回溫至少30min，將其置于微量離心機(jī)內(nèi)低速離心。將瓶?jī)?nèi)的粉末離心到管底后，再開蓋。

2.2 往一管FerroFarRed（50nmol）內(nèi)加入50μl 高質(zhì)量DMSO，用槍反復(fù)吹吸5次或以上，使其完全溶解即得到1mM FerroFarRed儲(chǔ)存液。【注意：FerroFarRed是藍(lán)色固體，但溶液幾乎無色（淺藍(lán)色）】。建議單次用完儲(chǔ)存液，若實(shí)在用不完，請(qǐng)根據(jù)單次用量分裝，置于-80℃避光保存。用中性緩沖液來稀釋儲(chǔ)存液。

三、HeLa細(xì)胞Fe²⁺的染色步驟（熒光成像分析）

3.1 在玻底培養(yǎng)皿內(nèi)接種細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。

3.2從培養(yǎng)皿內(nèi)吸走培養(yǎng)基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗兩次。

3.3 用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1uM FerroFarRed儲(chǔ)存液，制備成5mM的染色工作液。

3.4 將染色工作液加入培養(yǎng)皿內(nèi)，于37℃孵育1h。

【注意：①建議根據(jù)細(xì)胞類型和自身實(shí)際需求優(yōu)化工作濃度和孵育時(shí)間。②如果細(xì)胞很容易從培養(yǎng)皿上脫落，建議使用多聚L-賴氨酸或其它包被基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿來接種細(xì)胞。】

3.5 染色后用觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗一次，替換成新的觀察緩沖液。

3.6 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

四、HepG2細(xì)胞Fe²⁺的測(cè)定（流式分析）

4.1 于多孔培養(yǎng)板內(nèi)接種細(xì)胞，過夜培養(yǎng)。

4.2 從培養(yǎng)板內(nèi)吸走培養(yǎng)基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）輕輕的清洗兩次。

4.3 用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1uM FerroFarRed儲(chǔ)存液，制備成5mM的染色工作液。

4.4 將染色工作液加入培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃孵育1h。

【注意：建議根據(jù)細(xì)胞類型和自身實(shí)際需求優(yōu)化工作濃度和孵育時(shí)間。】

4.5 染色后，用PBS清洗一次，之后加入0.25% 胰酶-EDTA消化細(xì)胞。

4.6 于冰上用PBS稀釋0.25% 胰酶-EDTA，之后500 x g離心細(xì)胞懸液5min，以沉淀細(xì)胞。

【注意：不可用血清來中和胰酶。】

4.7 吸走上清，用PBS重懸細(xì)胞。

4.8 用細(xì)胞篩網(wǎng)（40μm尼龍篩網(wǎng)）過濾細(xì)胞，去除細(xì)胞碎片。

4.9 上機(jī)，流式細(xì)胞儀分析。

五、熒光檢測(cè)

對(duì)于激光激發(fā)：635nm波長(zhǎng)左右的激光器比較適合。熒光在660nm左右觀察。

對(duì)于熒光顯微鏡觀察：選擇檢測(cè)Cy5的紅色激發(fā)濾片。對(duì)于流式分析，選擇檢測(cè)APC的濾片。

注意事項(xiàng)：

1.      FerroFarRed傾向定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但也可能檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)池內(nèi)的Fe²⁺，目前針對(duì)這一點(diǎn)未做明確評(píng)估。

2.       熒光染料均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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