EcoRI, ADCF

產品簡介：

EcoRI, ADCF 經過基因工程重組，能夠在 15 min~1 h 內精確完成質粒 DNA、PCR 產物或基因組 DNA 等的酶切。

本品的發酵重組表達、純化、制劑等各個環節，都不使用包含動物來源的成分，也未使用抗生素。

識別位點：

GAATTC
5'...G ↓ A A T T C...3'
3'...C T T A A ↑ G...5'

同裂酶：FunII

注：同裂酶對于不同的甲基化修飾也許具有不同敏感性。

注：ADCF(animal derived component free), 不含動物源性相關組分。

產品組成：

保存條件: 

-20℃保存，2年有效。

特性和用法:

? 生產全程無動物源性成分

? 質量標準更高，嚴格控制宿主殘留

? 滿足疫苗生產要求

失活條件：

80℃溫育20 min。

甲基化敏感性：

對于被 CpG 甲基化的DNA，剪切可能受阻，
對于被 EcoBI 甲基化的 DNA，剪切可能受阻。

活性定義:

1 活性單位 (U) 是指在 50 μl 反應體系中，37℃ 1 h內完全酶切 1 μg λDNA 所需的酶量。

蛋白純度檢測:

本品經SDS-PAGE檢測純度 ≥95%。

核酸內切酶殘留檢測：

將20 U酶液與超螺旋質粒DNA 在37℃ 溫育4 h，通過 DNA 電泳檢測質粒無變化。

藍白斑檢測：

將含有單一lacZα基因的載體以1 μl EcoRI, ADCF消化，重新連接后轉化入大腸桿菌感受態細胞，涂布在含有對應抗生素、IPTG和 X-gal 的 LB培養基平板上。連接正確的產物會生長出藍色菌落，而連接錯誤（即DNA末端切口不完整）的產物將得到白色菌落。對于 ADCF系列限制酶而言，白色菌落比例應小于1%。

DNase 殘留檢測：

將20 U酶液與雙鏈 DNA 底物在37℃ 溫育16 h，通過 DNA電 泳檢測雙鏈DNA底物無變化。

RNase 殘留檢測：

將20 U酶液與RNA在37℃ 溫育1 h，通過電泳檢測RNA無降解。

酶切 - 連接 - 再酶切檢測：

最適反應溫度下，將20 U酶液消化底物，回收酶切產物，在 22℃下使用適量 T4 DNA Ligase (Fast) 可以將酶切產物重新連接, 將連接產物再次回收后，使用相同的內切酶可以重新切開連接產物。

宿主DNA殘留檢測：

將酶液中殘留的核酸經E.coli 16S rDNA特異性的TaqMan qPCR檢測，E.coli 基因組殘留低于 10 pg。

宿主蛋白殘留檢測：

本品經ELISA法檢測E.coli宿主蛋白含量≤ 50 ppm。

微生物限度檢測：

本品經微生物計數法檢測，需氧菌總數≤5 cfu/ml，霉菌和酵母菌 總數≤5 cfu/ml。

細菌內毒素殘留檢測：

本品細菌內毒素殘留＜0.5EU/KU

使用方法：

① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應體系：

a. DNA 底物中應不含苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、洗滌劑或高濃度鹽，否則將會影響EcoRI, ADCF 酶活性；甲基化的 DNA 會抑制某些限制性內切酶酶切反應。

② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴；

③ 37℃溫育15 min~1 h，一般推薦5 U~10 U酶/μg DNA、10 U~20 U酶/μg基因組DNA，溫浴1 h，如需過夜酶切反應，請將酶量調整至 1U；

④ 80℃溫育20 min即可使酶失活，停止反應，或者通過吸附柱或苯酚/氯仿純化終止反應； ⑤ 反應體系中加入的酶體積不應超過總體積的10%，避免酶中過多的甘油引起星號活性;

⑥ 限制性內切酶存儲緩沖液中的添加劑(例如甘油、鹽)與底物溶液中的污染物(例如鹽、EDTA 或乙醇等)相同，反應體積越小，酶切反應抑制效應越強；

⑦ 小體系推薦加樣體系：

b. 為避免蒸發，10 μl反應體系的孵育時間不應超過1 h。

不同DNA中的酶切位點數量

甲基化修飾影響

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。