Zeocin Solution 博萊霉素溶液（100 mg/ml）

產(chǎn)品簡介：

Zeocin是博來霉素/腐草霉素（bleomycin/phleomycin）抗生素家族的成員之一，從輪枝鏈霉菌Streptomyces verticillus中分離得到。作用譜廣泛，對細菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳動物細胞具很強的毒性。

Zeocin是腐草霉素D1的商業(yè)名稱，一種堿性、水溶性、銅離子螯合的糖肽抗生素。銅離子的存在使得溶液為藍色，此銅螯合的形式為無活性。當抗生素進入細胞后，二價銅離子（Cu2+）被還原為一價銅離子（Cu+），并被細胞內(nèi)的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，最終導致細胞死亡。來自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因賦予Zeocin抗性，該基因編碼一種13,665Da大小的蛋白，以化學計量方式結(jié)合Zeocin，抑制其DNA雙鏈切割活性。因此，能表達此蛋白的真核和原核宿主細胞被賦予Zeocin抗性。

Phleomycin (腐草霉素) (貨號：NBS2094)也是博來霉素家族的糖肽抗生素，其有效成分和Zeocin (博萊霉素)基本一致，都為Phleomycin D1，抗性基因也都為Sh ble。兩者的配方有一定的區(qū)別，Zeocin是以Phleomycin D1為主要成分的一種試劑，添加了不同的輔料，更適用于哺乳動物細胞的篩選；而Phleomycin是結(jié)構(gòu)相似抗生素的混合物，它們的末端氨基有一定的區(qū)別，建議用于對Zeocin不敏感的細胞，如絲狀真菌和一些酵母等。

本品為溶于去離子水的無菌溶液，濃度為100mg/ml，細胞培養(yǎng)級別。

產(chǎn)品特性：

1）CAS NO.：11006-33-0

2）化學式：C55H83N19O21S2Cu

3）分子量：1137.41 g/mol

4）外觀：藍色溶液（100mg/ml in deionized，autoclaved water）

保存條件: 

-20℃避光保存，至少1年有效，避免反復凍融。

建議工作濃度：

1）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過5g/L）

2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養(yǎng)基）

3）哺乳動物細胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養(yǎng)基，根據(jù)細胞系而不同）

操作步驟（以哺乳動物細胞為例）

【注1】：Zeocin的殺滅機制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素B（hygromycin B），細胞不會聚集成團和從培養(yǎng)板表面脫落。一旦接觸到Zeocin，敏感細胞會出現(xiàn)如下的形態(tài)變化：1）細胞體積明顯增加（類似于巨細胞病毒感染容納性細胞引起的腫大效應）；2）異常的細胞形狀包括細胞長臂（long appendages）出現(xiàn)；3）胞漿內(nèi)出現(xiàn)大型空泡（源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或支撐蛋白的破裂）；4）質(zhì)膜和核膜破裂，導致膜上出現(xiàn)許多孔。這些敏感細胞最終會完全破損，僅僅以細胞碎片的形式存在。

【注2】：Zeocin抗性細胞按正常周期分化產(chǎn)生不同于敏感細胞的克隆。抗性細胞在形態(tài)上，與未接觸Zeocin的正常細胞沒有任何差異。

【注3】：Zeocin用于哺乳動物細胞篩選常用濃度為50-1000μg/ml（平均常用濃度為250-400μg/mL），影響篩選濃度的主要因素包括離子強度，細胞類型，細胞密度以及生長速率。以下步驟僅作參考，請根據(jù)自身實驗體系做適當調(diào)整。

一、細胞對Zeocin敏感性的確定（殺滅曲線建立）

1）重新鋪板或者將滿盤細胞重新分盤，使得細胞密度約25%，按照8個平板/組準備，培養(yǎng)24h，去除舊培養(yǎng)基。

2）加入含不同濃度Zeocin的篩選培養(yǎng)基，Zeocin濃度可設置為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個濃度做3個平行；也可根據(jù)自身實驗體系，設置不同的濃度梯度。

3）每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細胞的比例。選擇在合適時間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細胞的濃度為最佳工作濃度。【注】：若是難以在顯微觀察下區(qū)分活細胞，建議使用臺盼藍染色來計算存活細胞的數(shù)量，以確定Zeocin的最適濃度。

二、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系

1）轉(zhuǎn)染細胞，用100mm培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照。

2）轉(zhuǎn)染后，用預熱的1X PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。

3）轉(zhuǎn)染48-72h后，用含有最佳濃度Zeocin（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細胞。為了更好的鑒定和篩選細胞集落，建議將細胞按比例稀釋成一系列濃度。

【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，按照以下方法克服此類耐性：用含Zeocin培養(yǎng)基進行細胞分盤，置于37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養(yǎng)基的緩沖體系。重新將細胞置于37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間內(nèi)終止細胞分化，使得Zeocin能發(fā)揮作用，殺死細胞。

4）每3-4天更換新鮮的選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細胞集落。

5）挑選并轉(zhuǎn)移克隆到96或48孔板中。在進行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細胞密度近100%。

三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的維持培養(yǎng)

可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞：

1）使用含相同劑量Zeocin的篩選培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)；

2）降低Zeocin劑量為原來的一半進行維持培養(yǎng)；

3）使用正好能預防敏感細胞生長但不足以致死的Zeocin劑量來維持培養(yǎng)【根據(jù)殺滅曲線來判斷】；

Zeocin常用的工作濃度為100μg/ml，但是，最佳的工作濃度需要根據(jù)細胞類型和實際的實驗體系來確定。某些哺乳動物細胞的建議工作濃度列在下表：

注意事項：

1.      Zeocin對光敏感，需將抗生素，或含該抗生素的平板或培養(yǎng)基置于黑暗處。

2.      降低細菌培養(yǎng)基的鹽濃度，調(diào)整pH到7.5使其保持活性，因高離子強度和酸或堿性都會抑制Zeocin活性。

3.      儲存Zeocin在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4.      Zeocin有毒，操作時需注意防護，切勿與身體或皮膚直接接觸。

5.      Zeocin?是Invivogen公司的商標產(chǎn)品。

6.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常用篩選抗生素及其使用濃度: