G418 Sulfate (Geneticin) 遺傳霉素（凍干粉）

產品簡介：

G418，又稱為G418硫酸鹽（G418 Sulfate），遺傳霉素（Geneticin），是一種氨基糖苷類抗生素，結構上類似于慶大霉素B1（Gentamicin B1），對細菌、酵母菌、原蟲和蠕蟲、以及高等植物和哺乳動物細胞都有毒性。由紅橙小單孢菌（Micromonospora rhodorangea）代謝產生，與核糖體結合，引起翻譯中無意義突變鏈的產生，最終抑制多肽合成和蛋白延伸。G418在分子遺傳學實驗中普遍用作一種篩選抗生素。對G418的抗性主要由新霉素抗性基因（neo）賦予，位于轉座子Tn601(903)（氨基糖苷磷酸轉移酶3’[I]或APH 3’[I]）和Tn5（氨基糖苷磷酸轉移酶3’[II]或APH 3’[II]）。這些基因源自細菌，但可在真核細胞中表達。將這些基因中的任何一個導入細胞均可以使細胞獲得G418抗性，從而能在含G418的培養基中生長。

哺乳動物細胞中，當抗性基因neo整合進入真核細胞基因組，使其能編碼氨基糖苷磷酸轉移酶3’[II]（APH 3’[II]），此酶通過共價修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產生G418抗性。

植物細胞中，當抗性基因nptII導入細胞內，其也能編碼氨基糖苷磷酸轉移酶，從而使得多種抗生素喪失活性，包括G418，卡那霉素和巴龍霉素。

我司提供兩種形式的G418硫酸鹽，

一種以凍干粉形式提供（貨號：NBS2099-1g，NBS2099-5g），易溶于水（50mg/mL）。需過濾除菌后使用。

一種以溶于水的儲存液形式提供（貨號：NBS2099-20ml），無菌溶液，可直接使用。

對于基因篩選實驗，需要建立殺滅曲線（劑量反應曲線）確定能夠殺死無抗性細胞的最低有效濃度。

產品特性：

1） CAS NO.：108321-42-2

2） 同義名：G-418; G418; Antibiotic G418 sulfate; G 418 disulfate salt; Geneticin; Glycoside-418, Sulfate; BRN 1669188; G418硫酸鹽；G-418硫酸鹽；G418二硫酸鹽；遺傳霉素；

3） 分子式：C20H40N4O10· 2H2SO4

4） 分子量：692.7

5） 外觀：白色至類白色粉末

6） 純度：≥98%（HPLC）

7） 活性：≥700 μg/mg（基于干重）

8） 化學結構圖

保存條件: 

凍干粉-20℃干燥保存，至少3年有效，防止受潮，否則會引起抗生素活性降低。

儲存液-20℃保存，至少2年有效。

產品使用：

一、  G418儲存液的制備

1.1   對于G418凍干粉（貨號：NBS2099-1g，NBS2099-5g）

1）活力單位的換算

公式：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對應的質檢報告，或者瓶子上的標簽。A1是想配制的G418活性濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。

示例：若所用批次的G418 活力值為：720 μg/mg，要配制50mg/mL的G418活性濃度，則實際要配制的粉末濃度為1000/720×50 mg/ml=69.44 mg/mL。

如果配制10ml的G418儲存液（活性濃度，50 mg/ml），則需要稱取694.4mg粉末。

2）除菌和保存

根據上述換算得到的實際粉末稱重，加入10 ml去離子水內使其完全溶解。

先用5ml去離子水預濕潤0.22μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1ml）放到-20℃凍存，2年穩定。

【注意】：①不要對混濁的溶液進行過濾，因為混濁的溶液意味著未完全溶解，過濾過程中會造成藥物損失，降低終液的活性。②不建議使用液體培養基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機溶劑來制備儲存液。

1.2   對于G418儲存液（貨號：NBS2099-20ml）

本品是基于G418活性濃度配制的無菌溶液，活性濃度為50mg/mL，收到貨第一次使用，可將本品按照更小規格分裝，-20℃保存，以延長本品的保存周期。若使用頻繁，可將本品置于2-8℃保存，至少1年穩定。

二、  常用篩選濃度

一般來說，剛開始篩選轉化子需要高濃度的G418，并用一個較低濃度的G418用于維持培養。生長條件，細胞類型和其他的環境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實驗體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應性曲線，來確定最佳篩選濃度。

通常情況，哺乳動物細胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細胞：10-100 μg/mL；酵母細胞：500-1000 μg/mL；網柄菌屬：10-100μg/mL；

以下是一些細胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

三、  殺滅曲線的建立

為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素最低濃度，可通過建立殺滅曲線（劑量反應曲線）來實現，至少選擇6個濃度。處理分裂期的細胞時G418的活性最強，因此在添加G418之前需要讓細胞培養一段時間。

3.1 第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，37℃，CO₂培養過夜；【注意】：對于需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量。

3.2 根據細胞類型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3.3 第二天：去除舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個濃度做三個平行孔。

3.4 接下來每3-4天更換新的含藥物培養基。

3.5 按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的最低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

四、  穩定轉染細胞的篩選

4.1 轉染48h后，用含有適當濃度的G418篩選培養基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。【注意】：細胞處于活躍分裂狀態時抗生素的殺傷效果最好。當細胞過于稠密，其效率會降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細胞稀釋至豐度不超過25%。

4.2 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養基。

4.3 篩選7天后觀察并評估細胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細胞類型，轉染，以及篩選效果。

4.4 挑取并轉移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。

4.5 之后更換正常培養基培養即可。

注意事項：

1.      不要將G418和其他抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因為這些抗生素是G418的競爭性抑制劑。其他抗生素也有可能產生交叉反應。

2.      本品以粉末形式提供，非無菌的。因此，配制的溶液需經0.2μm濾膜過濾除菌后再使用。不可高壓滅菌。G418儲存液置于-20℃可穩定保存高達24個月，或置于2-8℃穩定保存高達6個月。

3.      配制G418溶液，一定要根據G418實際批次的活性（potency）來進行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。

4.      G418溶于水是呈酸性的，直接加入培養基通常會導致瞬間的pH變化，在含酚紅的培養基內會看容易看到顏色變化。如果培養基本身具有良好的緩沖性，經幾分鐘至數小時pH會回復到正常。如果pH變化是很看重的一個因素，可選擇用緩沖液溶液比如100mM HEPES來配制G418儲存液。

5.      G418加入培養體系中未轉染的細胞有可能不會被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細胞密度過高。另外，快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞，更容易被殺死。對照細胞（未轉染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉染細胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

6.      即使加入殺死劑量的G418，細胞可能會繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

7.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常用篩選抗生素及其使用濃度: