Click-iT EdU-594 細胞增殖檢測試劑盒(適用于FACS、FM)

產品簡介：

細胞增殖能力的檢測是評估細胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。目前 檢測細胞增殖的方法有很多。其中，公認最精確的檢測細胞增殖的方法是直接檢測細胞中DNA 的合成。由于該方法有放射性污染且很難實現單細胞檢測，隨后逐漸被基于抗體檢測的 BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU 法的缺點是需要變性 DNA后才能與抗體結合，導致DNA雙鏈結構被破壞，影響其他染料的結合，染色彌散，準確性降低等問題。不論是最初使用的放射性標記核苷摻入法，還是后續改進的基于抗體檢測的BrdU法，都有著一定的自身局限性。

EdU（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種含有一個乙炔基團的胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，當將其注射到動物體內或者對體外培養的細胞進行孵育，這些小分子能夠迅速擴散到各個器官組織，并滲入到細胞中，可以在細胞增殖時期代替胸苷（T） 摻入到新合成的DNA中。EdU分子中的乙炔基團能與熒光標記的疊氮化合物探針(如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647 等)在銅離子催化下發生點擊反 應(Click reaction)形成穩定的三唑環，因此可以使新合成的DNA被相應的熒光探針所標記。與 另外兩種方法相比，沒有放射性污染，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高。

本試劑盒可用于檢測體外培養的細胞或動物組織中細胞增殖情況。試劑盒中熒光探針為 紅色熒光，最大激發波長為593nm，最大發射波長為614nm，處于增殖的細胞被標記后，細 胞核會顯示出明亮的紅色熒光，通過配套常規細胞核染料共同標記細胞核（本試劑盒提供 Hoechst 33342 細胞核染料），可用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器直接觀察細胞增殖情況；也可以使用流式細胞儀檢測體外培養細胞群熒光強度，根據熒光強度，來判斷細胞周期中S期的DNA復制活性。

保存條件: 

-20℃避光保存，1年有效。

產品組成：

產品使用：

一、前期準備：

1.  將細胞按一定密度均勻種植于細胞培養板中（種植密度，由細胞大小、生長快慢等因素決定），待細胞貼壁或恢復正常狀態后，進行相應的藥物刺激等處理（如檢測懸浮細胞， 請按懸浮細胞常規操作方式進行，和貼壁細胞相比，相關步驟需添加離心步驟）；

2.  催化添加劑（試劑C）低速離心，加入1mL超純水溶解，并分裝后于-20℃存放備用。

二、體外細胞EdU標記、固定及通透：

1.  2×EdU 工作液配制：每1mL培養基中加入2μL EdU存儲液（10mM），即為20μM的 2×EdU 工作液，并放入培養箱中預熱（對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦 EdU 的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索）；

2.  以半換液的模式，將培養板中原細胞培養基吸除一半，并補加等體積預熱的2×EdU工作 液，孵育一定的時間（孵育的時間一般取決于對應的細胞生長周期，通常占細胞周期10% 左右的時間。對于大多貼壁且生長較快的細胞，建議孵育2h左右。具體情況，需要隨細胞特性、處理后實際情況等進行調整。如需孵育較長時間可適當降低EdU工作濃度；較短時間則可適當提EdU濃度）；

3.  將EdU標記孵育后的細胞樣品，用PBS緩沖液清洗1-2次后，加入固定液，覆蓋細胞即可，室溫固定15min（如需用流式檢測，貼壁細胞此步之前先消化重懸后再固定，后續按懸浮細胞的處理方式即可）；用PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min；

4.  去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細胞或組織即可，室溫孵育15min；

5.  去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5min，然后轉至步驟四。

三、動物EdU注射造模以及組織切片處理：

1.  根據實驗要求，以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾靜脈注射等方式對動物進行一次或多次EdU注射造模，一般實驗EdU用量和動物體重的比值為5mg/kg，具體注射量根據研究內容和動物情況而定。

2.  小腸等上皮組織細胞增殖速度快，大腦等組織細胞增殖速度慢，生長較快的組織部位通常標記時間小于12小時，而生長較慢的組織標記時間可能需幾天；最佳標記時間根據具體實驗而定，由于小腸上皮組織增殖較快，建議取該類組織作為標記參考；

3.  將造模動物按照規定處死后，取出所需的組織，按照常規步驟制作冰凍切片或石蠟切片。

a)     對于冰凍切片：放置恢復到室溫，加入適量固定液，室溫固定15min。去除固定液，用適量PBS緩沖液洗滌3次，每次3-5min；去除PBS緩沖液，用適量通透液覆蓋組織室溫 孵育10-15min；去除通透液，用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5min，然后轉至步驟四；

b)     對于石蠟切片：切片脫蠟復水，PBS洗滌5min。去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細胞或組織即可，室溫孵育15min；去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5 min，然后轉至步驟四。

四、EdU檢測：

1.  在細胞或組織固定和穿孔期間，配制點擊反應液（對于不同樣本配制體系參考以下表中方 案）對于體外培養細胞：本參考步驟是對應10個96孔板樣品的體積用量（每孔100μL）， 可根據使用需求，等比例增加或減少配制量，請按下表順序依次添加組分，邊加邊混勻 （現配現用）；

對于組織細胞切片：參考下體系進行點擊反應液體系的配制，可根據切樣本數，等比例增加或減小配制量， 每個切片樣本約用 100-200μL 的點擊反應液覆蓋。

2.  去除上一步的PBS緩沖液，加入點擊反應液，輕搖保證反應液全部覆蓋細胞或組織，室溫避光孵育30min；

3.  去除點擊反應液，PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min（如無其他特別要求，即可用流式細胞儀檢測其熒光強度或用其他儀器檢測熒光效果）。

五、細胞核染色：

1.  去除上一步PBS緩沖液，將Hoechst33342染色液與PBS緩沖液以1比500-1000比例稀釋后，加入覆蓋細胞，孵育5min；

2.  去除Hoechst33342染色液，PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min。

六、成像以及檢測分析：

直接將體外培養的細胞或者組織切片樣品置于熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等儀器檢測， 分析處于增殖的細胞占比；或者收集體外培養的細胞，用流式細胞儀檢測熒光強度（建議使用未經EdU標記的細胞樣品作為流式細胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓），根據熒光強度，來判斷細胞周期中S期的DNA復制活性。本試劑盒熒光染料iF594（試劑B）對應的光譜特性為Ex/Em：593nm/614nm（紅色）；Hoechst33342染色液對應的光譜特性為Ex/Em：346 nm/460 nm（藍色）。

注意事項：

1.      對于常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25小時，孵 育時間宜在2小時左右。人胚胎細胞的細胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘； 酵母細胞的細胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經細胞其細胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度； 孵育時間大于20小時時，建議適當降低EdU的濃度。

2.      對于體外培養細胞，具體EdU使用濃度、孵育時間隨樣品以及研究目的的不同，可進行適當調整。

3.      部分組織細胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品 作為參照樣本（如腸道組織）。

4.      背景顏色過深，可能是實驗中洗滌不充分、組織樣品固定時間過長、固定液殘余導致。

5.      EdU催化添加試劑（試劑C）易氧化，盡量避免長時間暴露于空氣中，配制成水溶液后， 建議分裝保存；經測試，如EdU催化添加試劑顏色發生輕微變化，點擊反應催化體系依舊能夠正常進行，如呈現棕色，表明該組分已失效，請棄用。

6.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 

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