Click-iT EdU-647細(xì)胞增殖檢測試劑盒(適用于FACS、FM)

產(chǎn)品簡介：

細(xì)胞增殖能力的檢測是評估細(xì)胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。目前 檢測細(xì)胞增殖的方法有很多。其中，公認(rèn)最精確的檢測細(xì)胞增殖的方法是直接檢測細(xì)胞中DNA 的合成。由于該方法有放射性污染且很難實現(xiàn)單細(xì)胞檢測，隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU 法的缺點是需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，導(dǎo)致DNA雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，影響其他染料的結(jié)合，染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問題。不論是最初使用的放射性標(biāo)記核苷摻入法，還是后續(xù)改進的基于抗體檢測的BrdU法，都有著一定的自身局限性。

EdU（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種含有一個乙炔基團的胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，當(dāng)將其注射到動物體內(nèi)或者對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進行孵育，這些小分子能夠迅速擴散到各個器官組織，并滲入到細(xì)胞中，可以在細(xì)胞增殖時期代替胸苷（T） 摻入到新合成的DNA中。EdU分子中的乙炔基團能與熒光標(biāo)記的疊氮化合物探針(如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647 等)在銅離子催化下發(fā)生點擊反應(yīng)(Click reaction)形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，因此可以使新合成的DNA被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記。與另外兩種方法相比，沒有放射性污染，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高。

本試劑盒可用于檢測體外培養(yǎng)的細(xì)胞或動物組織中細(xì)胞增殖情況。試劑盒中熒光探針為 粉色（遠(yuǎn)紅外）熒光，最大激發(fā)波長為656nm，最大發(fā)射波長為670nm，處于增殖的細(xì)胞被標(biāo)記后，細(xì)胞核會顯示出明亮的紅色熒光，通過配套常規(guī)細(xì)胞核染料共同標(biāo)記細(xì)胞核（本試劑盒提供 Hoechst 33342 細(xì)胞核染料），可用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器直接觀察細(xì)胞增殖情況；也可以使用流式細(xì)胞儀檢測體外培養(yǎng)細(xì)胞群熒光強度，根據(jù)熒光強度，來判斷細(xì)胞周期中S期的DNA復(fù)制活性。

保存條件: 

-20℃避光保存，1年有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

一、前期準(zhǔn)備：

1.  將細(xì)胞按一定密度均勻種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中（種植密度，由細(xì)胞大小、生長快慢等因素決定），待細(xì)胞貼壁或恢復(fù)正常狀態(tài)后，進行相應(yīng)的藥物刺激等處理（如檢測懸浮細(xì)胞， 請按懸浮細(xì)胞常規(guī)操作方式進行，和貼壁細(xì)胞相比，相關(guān)步驟需添加離心步驟）；

2.  催化添加劑（試劑C）低速離心，加入1mL超純水溶解，并分裝后于-20℃存放備用。

二、體外細(xì)胞EdU標(biāo)記、固定及通透：

1.  2×EdU 工作液配制：每1mL培養(yǎng)基中加入2μL EdU存儲液（10mM），即為20μM的 2×EdU 工作液，并放入培養(yǎng)箱中預(yù)熱（對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細(xì)胞，推薦 EdU 的使用終濃度為10μM。但細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細(xì)胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索）；

2.  以半換液的模式，將培養(yǎng)板中原細(xì)胞培養(yǎng)基吸除一半，并補加等體積預(yù)熱的2×EdU工作 液，孵育一定的時間（孵育的時間一般取決于對應(yīng)的細(xì)胞生長周期，通常占細(xì)胞周期10% 左右的時間。對于大多貼壁且生長較快的細(xì)胞，建議孵育2h左右。具體情況，需要隨細(xì)胞特性、處理后實際情況等進行調(diào)整。如需孵育較長時間可適當(dāng)降低EdU工作濃度；較短時間則可適當(dāng)提EdU濃度）；

3.  將EdU標(biāo)記孵育后的細(xì)胞樣品，用PBS緩沖液清洗1-2次后，加入固定液，覆蓋細(xì)胞即可，室溫固定15min（如需用流式檢測，貼壁細(xì)胞此步之前先消化重懸后再固定，后續(xù)按懸浮細(xì)胞的處理方式即可）；用PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min；

4.  去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細(xì)胞或組織即可，室溫孵育15min；

5.  去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5min，然后轉(zhuǎn)至步驟四。

三、動物EdU注射造模以及組織切片處理：

1.  根據(jù)實驗要求，以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾靜脈注射等方式對動物進行一次或多次EdU注射造模，一般實驗EdU用量和動物體重的比值為5mg/kg，具體注射量根據(jù)研究內(nèi)容和動物情況而定。

2.  小腸等上皮組織細(xì)胞增殖速度快，大腦等組織細(xì)胞增殖速度慢，生長較快的組織部位通常標(biāo)記時間小于12小時，而生長較慢的組織標(biāo)記時間可能需幾天；最佳標(biāo)記時間根據(jù)具體實驗而定，由于小腸上皮組織增殖較快，建議取該類組織作為標(biāo)記參考；

3.  將造模動物按照規(guī)定處死后，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。

a)     對于冰凍切片：放置恢復(fù)到室溫，加入適量固定液，室溫固定15min。去除固定液，用適量PBS緩沖液洗滌3次，每次3-5min；去除PBS緩沖液，用適量通透液覆蓋組織室溫 孵育10-15min；去除通透液，用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5min，然后轉(zhuǎn)至步驟四；

b)     對于石蠟切片：切片脫蠟復(fù)水，PBS洗滌5min。去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細(xì)胞或組織即可，室溫孵育15min；去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次，每次3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟四。

四、EdU檢測：

1.  在細(xì)胞或組織固定和穿孔期間，配制點擊反應(yīng)液（對于不同樣本配制體系參考以下表中方 案）對于體外培養(yǎng)細(xì)胞：本參考步驟是對應(yīng)10個96孔板樣品的體積用量（每孔100μL）， 可根據(jù)使用需求，等比例增加或減少配制量，請按下表順序依次添加組分，邊加邊混勻 （現(xiàn)配現(xiàn)用）；

對于組織細(xì)胞切片：參考下體系進行點擊反應(yīng)液體系的配制，可根據(jù)切樣本數(shù)，等比例增加或減小配制量， 每個切片樣本約用 100-200μL 的點擊反應(yīng)液覆蓋。

2.  去除上一步的PBS緩沖液，加入點擊反應(yīng)液，輕搖保證反應(yīng)液全部覆蓋細(xì)胞或組織，室溫避光孵育30min；

3.  去除點擊反應(yīng)液，PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min（如無其他特別要求，即可用流式細(xì)胞儀檢測其熒光強度或用其他儀器檢測熒光效果）。

五、細(xì)胞核染色：

1.  去除上一步PBS緩沖液，將Hoechst33342染色液與PBS緩沖液以1比500-1000比例稀釋后，加入覆蓋細(xì)胞，孵育5min；

2.  去除Hoechst33342染色液，PBS緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min。

六、成像以及檢測分析：

直接將體外培養(yǎng)的細(xì)胞或者組織切片樣品置于熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等儀器檢測， 分析處于增殖的細(xì)胞占比；或者收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強度（建議使用未經(jīng)EdU標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為流式細(xì)胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓），根據(jù)熒光強度，來判斷細(xì)胞周期中S期的DNA復(fù)制活性。本試劑盒熒光染料iF647（試劑B）對應(yīng)的光譜特性為Ex/Em：656nm/670nm（粉色）；Hoechst33342染色液對應(yīng)的光譜特性為Ex/Em：346 nm/460 nm（藍色）。

注意事項：

1.      對于常見的哺乳動物細(xì)胞如HeLa、3T3、HEK293等，細(xì)胞周期大約在18-25小時，孵 育時間宜在2小時左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘； 酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細(xì)胞其細(xì)胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度； 孵育時間大于20小時時，建議適當(dāng)降低EdU的濃度。

2.      對于體外培養(yǎng)細(xì)胞，具體EdU使用濃度、孵育時間隨樣品以及研究目的的不同，可進行適當(dāng)調(diào)整。

3.      部分組織細(xì)胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品 作為參照樣本（如腸道組織）。

4.      背景顏色過深，可能是實驗中洗滌不充分、組織樣品固定時間過長、固定液殘余導(dǎo)致。

5.      EdU催化添加試劑（試劑C）易氧化，盡量避免長時間暴露于空氣中，配制成水溶液后， 建議分裝保存；經(jīng)測試，如EdU催化添加試劑顏色發(fā)生輕微變化，點擊反應(yīng)催化體系依舊能夠正常進行，如呈現(xiàn)棕色，表明該組分已失效，請棄用。

6.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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